【中英文題目】
利用RenSeq和sMrt測序技術可以加速馬鈴薯抗晚疫病基因的克隆
Accelerated cloning of a potato late blight–resistance gene using renseq and sMrt sequencing
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【基本信息】
期刊：Nature Biotechnology
年份：2016
IF: 43.113
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【摘要】
受到馬鈴薯晚疫病病菌引起的晚疫病的影響，馬鈴薯和番茄的全球產量大幅度下降。大部分的商業化馬鈴薯品種為易感晚疫病品種，而一些野生的馬鈴薯品種則表現出不同的抗性，因此可以作為研究抗晚疫病病菌(Rpi)相關基因的有效資源。已經有抗性育種研究發現了Rpi基因，但是耗時很多。文章報道了也升雙倍體非塊莖培育的茄科植物龍葵(Solanum americanum)包含了多個Rpi基因，同時，結合利用單分子實時測序技術獲得的抗性基因(R基因)來克隆Rpi-amr3i，這項技術能夠對無特征表型種質的完整核苷酸結合、富含亮氨酸重復受體(NLR)基因及其轉錄調控元件和復合多NLR位點進行從頭組裝。因此，SMRT RenSeq可以被應用于設計抗病作物，快速克隆R基因。
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【研究思路】
取材：
本研究所用材料來自溫室培育下的S. americanum sensu lato. S. americanum（茄科植物）
P. infestans晚疫病病菌來自波蘭植物育種和馴化研究所
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文庫構建及測序策略：
使用DNeasy Plant Mini Kit提取新葉中的基因組DNA，構建gDNA文庫;
使用TRI-Reagent (Sigma-Aldrich, MO, USA)和Direct-zol RNA MiniPrep Kit提取RNA，構建cDNA文庫
之后，BGI（華大）進行WGS測序，測序深度約30×
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信息分析：
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【研究結果】
1、對于MiSeq和PacBio RenSeq測序reads組裝結果的比較
植物在檢測到體內的病原菌時會迅速激活防御系統抵抗疾病的發生，及時激活防御系統依賴于細胞表面受體或者細胞內免疫受體對于病原菌的識別，特別是亮氨酸富集重復蛋白家族(NLR)。植物參考基因可以被用來挖掘NLR基因的相關信息，生物素標記RNA序列文庫(RenSeq)可以用來合成并克隆NLRs相關的未測序單元，但是，大量拷貝數以及高度重復編碼序列將會影響到全NLR基因的從頭組裝的精確性。
為了加速Rpi基因（抗晚疫?。┑目寺?，以及省略掉細菌人工染色體和質粒文庫的構建，文章重新定義了RenSeq來捕獲和測序NLR片段，長達3.2kb. 本研究結合長讀段SMRT測序技術(SMRT ?RenSeq)對NLR進行富集研究，并對NLR短讀段和長讀段的組裝進行比較、將CLC或SPAdes NLR組裝并比對到長讀段的contigs上進一步證明SMRT RenSeq在捕獲>1kb兩側啟動子和終止子時的優越性（圖1a）。圖1a-c中，序列信息還表現出可能的調控元件，包括啟動子和終止子序列。通過對長讀段和短讀段組裝(SPAdes和CLC)結果的比較發現，SMRT RenSeq產生的reads可以組裝成完整的基因，包括調控元件。
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圖1 比較MiSeq和PacBio RenSeq測序reads組裝結果?(a)由SP2271 ROI reads組裝得到的長33-kb的Contig_7，包括四個完整的類R2 NLR基因和一個部分的NLR基因，同時，與相應的MiSeq reads組裝得到的contigs進行比較(Contig_7下面)。其中，紫色箭頭表示預測ORFs，黑色表示PacBio ROI read的測序深度；(b)長DNA文庫可以得到啟動子和終止子區域，比較PacBio ROI和MiSeq得到的contigs，分別用不同的顏色表示其鄰近5’區域的長度，其中，PacBio ROI得到的2.5 kb的contigs用藍色表示，3.5 kb的用深粉色表示，MiSeq利用CLC得到的contigs用綠色表示，利用SPAdes得到的contigs用深藍色表示；(c)利用PacBio ROI reads組裝得到的Rpi-amr3i contig的詳細示意圖，黃色表示ORF區域，NLR包含的典型的蛋白質結構域：紫色表示卷曲螺旋(CC)，藍色表示核苷酸結合位點(NB-ARC)，綠色表示亮氨酸富集重復(LRR)。用來組裝Rpi-amr3 contig的ROI reads用黑色表示
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2、對SP2271（茄科） NLRs的NB-ARC結構域的系統發育分析
圖2是對SP2271?NLRs的NB-ARC結構域構建的系統發育樹，表現出茄科植物的典型結構，其中TIR-NLR和CC-NLR的比例為1:4.7，與Brassicaceae（十字花科）相反。另外，與馬鈴薯和番茄的NLR系統發育樹進行比較發現一個特定分支的擴展(CNL-10)以及一個新分支的出現(CNL-17)。
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圖2 SP2271 NLRs的系統發育樹 ?基于泊松模型的最大似然法得到的系統進化樹顯示，363個注釋的NLR基因的NB-ARC結構域主要聚集在31個功能特征的植物R基因（紅色和藍色字體表示，CED4作為外群）；每個主分支的boostrap值大于等于70%的分別標記在圖中，TIR-NLR(TNL)分支用黃色背景表示，標簽表示的是基因ID；系統進化樹以一定的比例繪制而成，樹枝的長度與每個位點的替換數目成正比。
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3、候選基因Rpi-amr3i確實具有抵抗P. infestans（晚疫?。┑淖饔?/span>
SMRT-RenSeq有利于快速測定Rpi候選基因序列，通過PCR對這六個候選NLRs的ORFs進行擴增，隨后對Nicotiana benthamiana（煙草的一種）進行瞬時表達研究（圖3）證明了候選基因Rpi-amr3i的功能。接下來，本研究創造出攜帶有Rpi-amr3i的穩定轉基因作物，這樣的作物表現出抵抗所有的P. infestans病原菌的能力（圖3b）。這些結果均證實Rpi-amr3i對于抵抗晚疫病病毒P. infestans的功能。
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圖3 對N. benthamiana（煙草的一種）和穩定的轉基因馬鈴薯進行短暫互補分析發現候選基因Rpi-amr3i確實具有抵抗P. infestans（晚疫?。┑淖饔??(a) 雙載體pICSLUS0003?35S 侵染N. benthamiana葉子后，要么六個Rpi-amr3候選基因中的一個（陽性控制）過表達，要么GFP（陰性控制）過表達。隨后接種P. infestans發現，只有R2和Rpi-amr3i沒有被感染（如圖所示），而在其他Rpi-amr3候選基因以及GFP控制組中則發生嚴重感染。Rpi-amr3a對應的表型與所有不起作用的參考基因一樣。(b)轉基因雙倍體馬鈴薯“Line26” (Solynta B.V.)在固有調控元件下表達Rpi-amr3i抵抗P. infestans病原菌。相反，攜帶有無功能參考基因Rpi-amr3a的對照組植物則表現出大面積的芽孢化和壞死病變。
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【研究結論】
1、本研究運用SMRT RenSeq技術，即通過將兩種測序技術——“RenSeq”(抗性基因ENrichment SEQuencing)和“SMRT”(單分子實時測序)相結合，讓尋找、定義和引入遺傳抗性的過程，更快和更容易。
2、野生馬鈴薯近緣種Solanum americanum攜帶著幾個抗性基因，本研究通過使用新技術，迅速分離出一個新的抗性基因——Rpi-amr3。
3、希望這項新技術將提高商業作物收成，并將帶來更高的產量，顯著減少對環境的影響，并最終降低生產者和消費者的成本。
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【所用軟件和數據庫】
CLC Assembly Cell：一種高性能計算機解決方案，用于下一代測序數據的從頭組裝以及有參組裝
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Geneious R8：一款功能強大的用于分子生物學以及NGS分析的工具，它結合了所有主要的生物信息學分析工具
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BWA（Burrows-Wheeler Aligner ）：是一款十分優秀的序列比對軟件，它主要應用二代測序后的大量短小片段與參考基因組之間的定位比對
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Savant Genome Browser：適用于高通量測序數據的基因組瀏覽器，序列注釋，可視化和分析工具，用于基因組數據的一個桌面可視化和分析瀏覽器
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Samtools：是一系列處理BAM格式序列的應用，它從SAM(Sequence?Alignment/Map)格式輸入或者輸出為SAM格式，可以進行排序，合并和建立索引，并且允許快速地檢索任意區域的讀段（reads）
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CDD數據庫：保守結構域數據庫（Conserved Domain Database）是NCBI Entrez查詢和檢索系統的一部分，并且也能夠通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml訪問，CDD提供了帶有保守結構域足跡定位和從這些足跡中推斷的功能位點的蛋白質序列注釋。