?Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing. Nature Communications (2016.07) IF = 11.329
?? 玉米（Zea mays）是全球重要的農作物，也是研究植物轉錄組代謝通路的遺傳模型。玉米基因組序列于2009年公布，后續利用EST和RNA-Seq轉錄組數據對其基因注釋進行了補充。然而RNA-Seq中，短讀長無法提供轉錄本全長序列，限制了可變剪接形式的鑒定，同時，短讀長拼接會得到錯誤的轉錄本。
?? 近期，來自冷泉港實驗室等單位利用PacBio長讀長測序技術，對玉米6個組織進行了全長轉錄組測序分析，在已有的玉米B73 RefGen_v3上發現了大量新信息，揭示了玉米基因表達的復雜性。
?????? 研究材料： 取玉米自交系B73不同發育階段的6個組織（根、花粉、胚芽、胚乳、幼雌穗、幼雄穗），提取mRNA, 反轉錄過程中加組織特異性barcodes，按照等摩爾比值cDNA平均混合。
?????? 建庫測序：構建6種插入片段文庫（<1,1–2, 2–3, 3–5, 4–6 和>5 kb)后，加上序列特異性的barcode，上機46個SMRT Cell進行全長轉錄組測序。對6個組織進行二代RNA-Seq測序，每個樣品三個重復。
???????研究方法：通過已發表的甲基化數據，對isoform，lncRNA 和 non-lncRNA區域進行甲基化分析。
?????? 研究結果：
??1.下機得到了3,716,604條reads，過濾得到接近一半的全長轉錄本序列（1,553,692，42%）。ToFu處理得到643,330個高質量的轉錄本序列，其中606,145個序列（94.2%）能夠比對到玉米RefGen_v3參考基因組上。
??2.經聚類分析得到了111,151個isoform，對應26,943個基因，涵蓋了玉米RefGen_v3基因注釋的70%。其中57% isoform來自已知基因位點的新isoform；2,803個 (3%) 新isoform來自2,253個新位點（Fig. 1）。
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![全長轉錄組測序]( "全長轉錄組測序")
![全長轉錄組測序]( "全長轉錄組測序")
??Fig. 1 PacBio 和RefGen_v3的isoform比較
?? 3.在不同生長發育階段的6個組織中，花粉具有最多的組織特異性isoform（9,842，61.3%），其次是胚芽（20,050，49.2%），再次是胚乳（12,392，46.7%），根的isoform最少(13,386，44.6%) (Fig. 2)。GO 分析表明，這些組織特異性isoform，通常與組織特定的分子功能相關。?
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![全長轉錄組測序]( "全長轉錄組測序")
??Fig. 2 6種不同組織的所有PacBio Isoform
???? 4.?玉米RefGen_v3中，已注釋了來自57個家族的2,624個轉錄因子。在PacBio Isoform中發現了來自53個家族的新isoform，轉錄因子數量增至5,423個。其中155個新isoform與這些生長激素應答的功能相關。
???? 5.?已有研究中有1,704個高度可信的LncRNA（平均長度為463bp）。本次分析得到了878個LncRNA，其中11個是已有研究確定的， 另外867個是新發現的LncRNA（平均讀長為1.1kb）(Fig. 3)。
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![全長轉錄組測序]( "全長轉錄組測序")
Fig. 3 本次分析確定的新與已確定的lncRNAs 長度對比
????? ?6. 將PacBio isoforms與 Illumina短讀長組裝的isoform分析結果進行了比較，其中短讀長數據運用兩種分析方法（Cufflinks和Trinity）進行對isoform進行組裝，能鑒定到PacBio的isoform分別僅為22%和8%，表明轉錄組短讀長分析方法在檢測isoform的局限性，而PacBio長讀長能得到精確的isoform，尤其是在一個基因對應幾種isoform的復雜情況下優勢明顯。?
![全長轉錄組測序]( "全長轉錄組測序")
Fig 4. ?PacBio的isoform對短讀長組裝構建的isoform評估
??7. CHG甲基化主要富集在acceptor位點，CG甲基化主要富集在donor位點， donor位點的CG甲基化能夠促進可變剪接，CHH甲基化與可變剪接病沒有顯著的相關性。同時，發現non-lncRNA genes具有相對較高的CG甲基化水平，而lncRNAs具有相對較高的CHG甲基化水平，這些甲基化水平可能與基因的不同表達水平有關。
PacBio 超長讀長無需組裝即可得到全長轉錄組信息，直接獲得了isoform信息，解密玉米轉錄組復雜的基因表達信息。
?參考文獻
Bo Wang et al., (2016). Unveiling the complexity of the maize transcriptome bysingle-molecule long-read sequencing. NATURECOMMUNICATIONS.
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